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Report finale del progetto di ricerca "Utilizzo di cellule di Sertoli microincapsulate nella distrofia muscolare di Duchenne. Verso l’applicazione sui pazienti”

Il progetto, guidato da Guglielmo Sorci dell’Università di Perugia, della durata di due anni e finanziato da Parent Project aps, aveva come razionale quello di valutare l'effetto antiinfiammatorio delle cellule di Sertoli per combattere il processo infiammatorio e degenerativo del tessuto muscolare nella DMD con l'obiettivo di studiare alcuni parametri chiave della strategia per poter valutare il passaggio dagli studi preclinici alla sperimentazione clinica sui pazienti

Il team di Guglielmo Sorci, Professore di Anatomia Umana presso il Dipartimento di Medicina Sperimentale all'Università di Perugia, conclude il progetto di ricerca da noi finanziato e presenta alla comunità Duchenne un video con i principali risultati. Il progetto ha visto impegnate in tutte le fasi della ricerca sperimentali due giovani e promettenti ricercatrici della stessa università, Sara Chiappalupi e Laura Salvadori, che grazie al progetto hanno usufruito di un assegno di ricerca. Il progetto è iniziato il primo marzo del 2017 e, con un'estensione di pochi mesi per portare a termine il lavoro, è terminato il 28 agosto 2019.

Le cellule di Sertoli(SeC) sono presenti nei tubuli seminiferi del testicolo e hanno due funzioni principali: 

• separare le cellule germinali in via di sviluppo (quelle cellule che diventeranno spermatozoi) dal letto vascolare. Sono quindi una barriera fisica che impedisce al sistema immunitario di attaccare gli spermatozoi riconosciuti come cellule estranee all’organismo;
• secernere fattori trofici (nutritivi) e immunoregolatori, questi ultimi concorrono a bloccare localmente il sistema immunitario che altrimenti attaccherebbe le cellule germinali, riconosciute come estranee

In questo progetto, le SeC utilizzate sono state prelevate da testicoli di maiali prepuberi. Attualmente si utilizzano cellule di maiali SPF, Specific Pathogens Free, ovvero certificati per assenza di patogeni, idonei anche per trapianti nell’uomo. Le cellule di Sertoli sono state quindi isolate, purificate e incapsulate in alginato di bario, inerte e innocuo per l’uomo (le SeC-MC attualmente sono un prodotto brevettato). Questa importante parte del progetto è stata effettuata grazie alla collaborazione con i professori Giovanni Luca e Riccardo Calafiore dell’Università di Perugia.

Dati precedenti avevano evidenziato, a seguito di un singolo inoculo intraperitoneo di SeC microincapsulate (SeC-MC) nei topi distrofici (mdx), un netto miglioramento della morfologia muscolare, con riduzione della necrosi e dell’infiammazione e con un recupero della funzionalità muscolare sia nella fase acuta che in quella cronica della patologia. 

Il gruppo di ricerca ha dimostrato che questi effetti delle SeC sui muscoli distrofici sono dovuti a due principali meccanismi d’azione: 

• il rilascio di fattori antiinfiammatori e immunomodulatori responsabili della riduzione dell’infiammazione; 
• il rilascio di una proteina chiamata eregulina beta 1 che, attraverso il sangue, arriva nei muscoli e stimola la produzione di utrofina. 

Utrofina e distrofina sono due proteine molto simili che hanno una funzione corrispondente nei muscoli ed è stato dimostrato che l'utrofina può sostituire funzionalmente la distrofina nel topo. Nel muscolo degli adulti l'utrofina è poco espressa mentre sostituisce naturalmente la distrofina nel feto e nella rigenerazione muscolare dopo un danneggiamento. 

I principali obiettivi del progetto del gruppo del Professor Sorci erano: 

1. acquisire una conoscenza più dettagliata della biologia delle SeC all’interno delle microcapsule;
2. effettuare uno studio dose-risposta per individuare la dose minima efficace di SeC-MC;
3. indagare in dettaglio il meccanismo d’azione alla base degli effetti benefici indotti dalle SeC; 
4. dimostrare l’effetto immunomodulatorio e non immunosoppressivo delle SeC;
5. dimostrare la sicurezza di trattamenti con SeC-MC a lungo termine

Riassumiamo i principali risultati del progetto: 

• le cellule incapsulate potrebbero andare incontro a divisione cellulare, a morte cellulare o ad altri eventi che ne potrebbero in qualche modo influenzare l’azione. Pertanto, le microcapsule pronte per l’inoculo nella cavità peritoneale sono state analizzate al microscopio elettronico. I dati ottenuti dimostrano che la procedura di inclusione non altera la morfologia e la vitalità delle SeC in esse contenute;
• con esperimenti di co-coltura, in cui vengono messi in coltura i miotubi (i precursori delle fibre muscolari) insieme alle SeC, è stato dimostrato che le SeC sono capaci di indurre l’espressione di utrofina anche in miotubi di cani distrofici (GRMD) e di pazienti DMD con diversi tipi di mutazione nel gene della distrofina, con lo stesso meccanismo dimostrato in precedenza nei topi mdx;
• i ricercatori hanno dimostrato che anche dosi di SeC-MC più basse (fino a 10 volte inferiori) rispetto a quelle usate finora sono capaci di fornire effetti positivi a livello muscolare una volta iniettate nella cavità peritoneale, rappresentando una condizione vantaggiosa nel caso di un eventuale passaggio all’applicazione sull’uomo. Hanno quindi evidenziato un miglioramento nella morfologia muscolare, una risoluzione dell'infiammazione e una maggiore espressione di utrofina nei topi distrofici;
• in un altro modello animale, il topo mdx/Utrn-/-, che non è in grado di esprimere utrofina, l'inoculo intraperitoneo di SeC ha indotto un miglioramento della morfologia muscolare e una significativa riduzione dell'infiammazione. Ciò sta a indicare che l'effetto antiinfiammatorio indotto dalle cellule di Sertoli è indipendente dalla up-regolazione dell'utrofina, a sua volta indotta dal rilascio della eregulina beta 1; 
• i ricercatori hanno dimostrato che le SeC sono in grado di proteggere i miotubi dall’atrofia indotta artificialmente in vitro con diversi metodi [privazione di nutrienti, agenti pro-infiammatori e atrofizzanti (citochinine), un glucocorticoide (desametasone)], rivelando un’ulteriore potenzialità di queste cellule;
• topi precedentemente iniettati con SeC-MC e successivamente iniettati per via sottocutanea con cellule LLC (carcinoma polmonare di Lewis) o con cellule che provocano melanomi, hanno mostrato una crescita tumorale simile ai topi iniettati con microcapsule vuote (E-MC). Ciò indica che le cellule di Sertoli non hanno attività immunosoppressiva, non influenzano l'insorgenza del tumore e non favoriscono la crescita del tumore stesso. Tuttavia, i topi iniettati con SeC-MC hanno mostrato una significativa riduzione delle metastasi e riduzione generale dell'invasività dei tumori, una minore riduzione del peso corporeo indotta dal tumore nel tempo e una ridotta atrofia muscolare indotta dal cancro, rispetto ai topi di controllo. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che le SeC esercitano un effetto immunomodulatorio anziché immunosoppressivo, supportandone ulteriormente l'uso come potenziale trattamento dei pazienti con DMD;
• allo stesso modo, è stato osservato che topi inoculati con SeC-MC nella cavità peritoneale che erano stati precedentemente infettati con Aspergillus fumigatus, il fungo che più comunemente colpisce i polmoni di soggetti immunocompromessi, o con Candida albicans per via intragastrica, rispondono meglio e debellano l’infezione prima dei topi di controllo (infettati con l’agente patogeno ma non inoculati con le SeC-MC), confermando l’effetto immunomodulatorio delle SeC

Questi dati, insieme a quelli ottenuti nel punto precedente con le cellule tumorali, dimostrano che la presenza delle SeC-MC non compromette la risposta immunitaria nei topi, confermando un loro ruolo immunomodulatore ma non immunosoppressivo. Le celluledi Sertoli non sono quindi immunosoppressive, anzi rilasciano fattori che favoriscono una più rapida risoluzione dell'infezione provocata da diversi agenti patogeni.

A cura dell'Ufficio Scientifico di Parent Project aps

Potete leggere ulteriori informazioni su questo progetto al seguente link e il report del primo anno nella pagina dei progetti del nostro sito web.

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Report progetto Caratterizzazione del profilo genetico dei FAP durante la progressione della DMD e il trattamento con inibitori delle HDAC

Iniziato nel 2016, il progetto triennale di dottorato di ricerca di Luca Tucciarone coordinato da Pier Lorenzo Puri e Silvia Consalvi presso la Fondazione Santa Lucia IRCCS di Roma aveva come obiettivo principale quello di capire se esistono trattamenti in grado di ripristinare il corretto linguaggio con cui i FAPs coordinano le attività delle cellule in modo da favorire la rigenerazione muscolare nella DMD

Introduzione

Questo progetto di ricerca, finanziato da Parent Project aps e coordinato dal Dr. Pier Lorenzo Puri, ha consentito al team di ricercatori Silvia Consalvi e Luca Tucciarone di estendere i propri studi nell’ambito del trattamento farmacologico con gli inibitori delle HDAC (HDACi) per la Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD). In particolare, l’associazione di  pazienti e genitori con figli affetti da distrofia muscolare di Duchenne e Becker -Parent Project aps- ha finanziato il progetto di dottorato di ricerca della durata di tre anni del Dr. Luca Tucciarone, presso la Fondazione Santa Lucia IRCCS di Roma. Dopo anni di ricerca nel campo della DMD, il gruppo diretto da Puri ha identificato il potenziale terapeutico degli HDACi nel contrastare la progressione della patologia e ha svolto gli studi preclinici (Minetti et al. 2006; Consalvi et al., 2013) che hanno permesso di portare il primo HDACi -Givinostat– in sperimentazione clinica su pazienti affetti da DMD (Bettica et al. 2015).

Studi precedenti svolti dal gruppo di Puri avevano evidenziato come gli effetti benefici degli HDACi siano ottenuti attraverso la loro azione su una popolazione cellulare che svolge un ruolo chiave durante la rigenerazione muscolare, i progenitori fibroadipogenici (FAPs). I FAPs sono delle cellule che si trovano negli interstizi del tessuto muscolare e svolgono una doppia funzione di supporto nei confronti delle cellule staminali del muscolo (le cellule satelliti) durante il processo di riparazione del tessuto muscolare. Ovvero, in seguito a una lesione muscolare, i FAPs rilasciano fattori di crescita in supporto all’espansione e al differenziamento delle cellule staminali muscolari in miofibre e al contempo cambiano la composizone della matrice extracellulare interstiziale per facilitare la proliferazione e la migrazione delle stesse cellule staminali muscolari. Tuttavia, queste funzioni sono normalmente circoscritte in un ambito temporale compatibile con il completamento della rigenerazione muscolare. In condizioni di attivazione cronica e ripetuta della rigenerazione muscolare, come nella DMD, iFAPs si ritrovano a “lavorare” ininterrottamente per promuovere l’azione delle cellule staminali, perdendo progressivamente la loro capacità di supporto per le cellule staminali muscolari e acquisendo un fenotipo pro-fibrotico eadipogenico “costitutivo”. Ciò porta alla produzione di tessuto adiposo e fibrotico – gli eventi patologici che determinano la sostituzione di materiale contrattile con quello fibrotico e adiposo nei muscoli dei pazienti affetti da DMD negli stadi tardivi della patologia, in cui si assiste alla perdita della loro capacita’ contrattile.

Da studi pre-clinici su modelli murini della DMDcondotti dal gruppo di ricerca del Dr. Puri è emerso che il trattamento con HDACi induce i FAPs sa mantenere un’ azione pro-rigenerativa e previene la loro conversione in effettori cellulari della degenerazione fibro-adiposa dei muscoli. Gli stessi studi hanno tuttavia evidenziato che questi effetti terapeutici degli HDACi sono circoscritti nelle fasi precoci della patologia. La perdita degli effetti terapeutici degli HDACi, osservata negli stadi più avanzati della DMD, è almeno in parte dovuta a una resistenza dei FAPs agli HDACi (Mozzetta et al.,  2013; Saccone et al., 2014). 

Il passo successivo è stato quello di chiederci quali sono i meccanismi alla base della perdita di responsività agli HDACi da parte di FAPs dei muscoli a stadi tardivi della patologia e quali sono le alterazioni che durante la progressione della patologia conferiscono la resistenza al trattamento con HDACi.

È proprio su queste domande che si è basato il presente progetto di ricerca. Vale la pena sottolineare che la risposta a queste domande –che è l'obiettivo principale di questo studio - va ben oltre la curiosità scientifica che da sempre affama i ricercatori, poiché mira ad ampliare le attuali conoscenze sul meccanismo d’azione degli HDACi per avere una maggiore consapevolezza del loro utilizzo terapeutico in pazienti distrofici a diversi stadi di progressione della patologia.

Razionale dello studio

Al fine di comprendere i processi alla base della responsività agli HDACi, siamo andati a esplorare nel dettaglio i meccanismi con cui questi farmaci svologono i loro effetti biologici. Gli HDACi sono farmaci che inibiscono l’attivita’ di una classe di enzimi – istone deacetilasi (HDAC) – che regolano l’espressione genica attraverso dei meccanismi cosidetti “epigenetici”, ovvero attinenti a effetti che vanno al di là della genetica, in quanto in grado di influenzare l’attività del genoma senza modificarne la sequenza genica. Tra questi meccanismi esiste un codice di segnali che consiste in modificazioni degli istoni, la componente strutturale che regola l’accessibilitàal DNA delle proteine regolatrici della trascrizione. Una di queste modificazioni consiste nella deposizione di gruppi acetilici su degli aminoacidi (lisine) degli istoni, al fine di rilassare la struttura intorno al DNA e favorire la trascrizione dei geni in prossimità degli istoni. Questo processo, chiamato “acetilazione istonica” viene regolato negativamente dalle HDAC. Pertanto l’uso di HDACi promuove acetilazione istonica e l’espressione di geni altrimenti inibiti da HDAC. Questi farmaci trovano pertanto un’applicazione diretta in condizioni patologiche in cui sia stata identificata un’attivazione incontrollata delle HDAC, come nel caso della DMD (Colussi et al. 2008).

Nel nostro studio ci siamo avvalsi di una tecnologia (chiamata Chromatin Immuno precipitation associated with massive DNA sequencing – ChIPseq) in grado di esplorare l’attivita’ enzimatica delle HDAC e il profilo dell’acetilazione dell’intero genoma dei FAPs isolati da muscoli del modello murino di DMD (i topi mdx) a stadi iniziali e tardivi della patologia, e di valutarne la risposta agli HDACi. In parallelo, abbiamo monitorato l’espressione genica globale da parte delle stesse cellule, attraverso la tecnologia di RNAsequencing (RNAseq), al fine di identificare i geni regolati durante la progressione della patologia e in risposta al trattamento con HDACi

Risultati

I profili di acetilazione istonica identificati dalle analisis di ChIPseq hanno rivelato che i FAPs dei muscoli dei topi mdx a stadi tardivi della patologia acquisiscono un livello costitutivo di attività delle HDAC molto più alto di quello osservato nelle stesse cellule isolate da muscoli di topi mdx a stadi iniziali di patologia stessa. Pertanto il profilo di acetilazione ed espressione del genoma differiscono profondamente nelle FAPsdei muscoli di topi distrofici a stadi successivi di progressione della patologia. In particolare, le nostre analisi bio-informatiche relative all’integrazione dei dataset generati da ChIPseq e RNAseq hanno stabilito che i diversi profli di acetilazione istonica dei FAPs in muscoli di topi distrofici a diversi stadi di progresione della patologia sottendono differenze di espressione genica che conferiscono l’attivita’ pro-rigenerativa ai FAPs dei topi distrofici a stadi iniziali e la conversione da parte di FAPs dei topi distrofici a stadi tardivi in cellule “fibro-adipogeniche”. Sorprendentemente, queste analisi hanno mostrato che gli HDACi sono in grado di alterare il profilo di acetilazione di istoni da FAPs di muscoli distrofici sia a stadi iniziali che avanzati della patologia. Tuttavia, solo in FAPs di muscoli distrofici in stadi iniziali l’effetto di HDACi permetteva un profilo di acetilazione tale da promuovere l’espressione di geni pro-rigenerativi. In FAPs di muscoli distrofici a stadi avanzati l’inibizione di HDAC valeva a ripristinare un profilo di acetilazione istonica simile a quello degli stadi iniziali, ma non era equivalente all’effetto di HDACi sugli stessi FAPs di muscoli a stadi iniziali di progressione della malattia. 

Questi risultati indicano che l’inibizione farmacologica di HDAC non è di per sé inefficace a stadi tardivi della DMD, in quanto è in grado di riportare i livelli di acetilazione e l’espressione genica dei FAPs a quelli degli stadi precoci. Un effetto interessante in termini di un potenziale recupero di alcune proprietà biologiche caratteristiche degli stadi iniziali della DMDè la loro capacità rigenerativa “compensatoria”. L’assenza di effetti terapeutici in FAP dei muscoli distrofici a stadi tardivi da parte di HDACi usati agli stessi dosaggi con cui svolgono un’attività terapeutica in FAPs di muscoli distrofici a stadi inizialie con cui inibiscono con uguale efficacia l’attività enzimatica di HDAC sia in stadi iniziali che tardivi, suggerisce l’esistenza di una potenziale soglia terapeutica di acetilazione. Nella DMD questa soglia tende a crescere con la progressione della patologia e non èpiù raggiungibile con gli stessi dosaggi di un farmaco (HDACi) che mostrano attivita’ terapeutica in stadi iniziali, in cui la soglia terapeutica di acetilazione èpiù bassa.   

L’identificazione di una potenziale soglia di acetilazione terapeutica ha ispirato una ricerca successiva a questi studi e volta allo sviluppo di combinazioni di farmaci epigenetici con funzioni sinergistiche – per esempio, la ricerca di un farmaco in grado di sinergizzare con HDACi o HDACi tollerabili ad alti dosaggi, in grado di raggiungere una soglia di acetilazione terapeutica in FAPs di muscoli distrofici a stadi tardivi di progressione dellapatologia.   

L’analisi del profilo genomico dei FAPs durante la progressione della DMD ha anche mostrato un aspetto biologico di particolare interesse alla luce di un recente nostro studio che ha rivelato come l’azione dei FAPs sulle cellule staminali muscolari venga mediata da minuscole vescicole extracellulari che veicolano delle “istruzioni” sotto forma di acidi ribonucleici e proteine. Nel caso di un muscolo distrofico queste “istruzioni” sono errate e, pertanto, non si ha un’efficiente rigenerazione. Il trattamento con HDACi è in grado di correggere le “istruzioni” rilasciate nelle vescicole, e indurre così le cellule satelliti a esercitare la loro attività pro-rigenerativa e anti-fibrotica (Sandonà et al., 2020). Il nostro studio dimostra adesso chein muscoli distrofici astadi avanzati i FAPs acquisiscono una maggiore capacità di produrre vescicole extracellulari, il cui contributo contribuisce a generare un ambiente senescente e fibrotico. Il trattamento con HDACi riduce la produzione di queste vescicole da FAPs di muscoli distrofici in stadi avanzati. Pertanto, a differenza di quanto succede neiFAPsa stadi precoci, dove gli HDACi modulano il contenuto delle vescicole convertendole in pro-rigenerative e anti-fibrotiche, nel caso deiFAP sa stadi tardivi gli HDACi bloccano solo la produzione di vescicole, perdendone i benefici della loro conversione farmacologica. 

Conclusioni:

Questo lavoro chiarisce alcuni aspetti molecolari fondamentali della patogenesi della DMD e svela che quella che era inizialmente considerata una resistenza al trattamentopotrebbe essere bypassata da HDACi tollerati a dosaggi più alti ed eventualmente a co-trattamenti complementari in grado di ripristinare il potenziale rigenerativo degli HDACi. Testare queste ipotesi è sicuramente il nostro prossimo obiettivo. Con il supporto di Parent Project aps, stiamo infatti attualmente valutando strategie terapeutiche in combinazione con gli HDACi per estendere gli effetti benefici del trattamento agli stadi più avanzati della DMD. 

Il nostro studio rimarca inoltre il potenziale terapeutico delle vescicole extracellulari come nuovo strumento farmacologico in grado di essere manipolato per veicolare, anche localmente,istruzioni per mantenere l’integrità funzionale dei muscoli distrofici, specialmente in stadi avanzati della DMD.

Infine, pur non determinando un chiaro effetto terapeutico pro-rigenerativo, il trattamento con HDACi a stadi tardivi sottende un nuovo e inatteso effetto anti-senescenza dall’enorme potenziale, in quanto potrebbe ripristinare un ambiente muscolare più permissivo alla rigenerazione e quindi più responsivo a terapie geniche o cellulari. Questo è sicuramente il messaggio più importante per la comunità di pazienti distrofici a stadi avanzati di DMD che restano attualmente esclusi dalla maggior parte dei trial, perché significherebbe tornare a essere candidabili per gli studi clinici e offrire quindi anche a loro la prospettiva di un trattamento. Questa è definitivamente la nostra missione.

Referenze

1. Consalvi S., Mozzetta C., Bettica P., Germani M., Fiorentini F., Del Bene F., Rocchetti M., Leoni F., Monzani V., Mascagni P., Puri PL, Saccone V. Preclinical.studies in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy with the histone deacetylase inhibitor givinostat. Mol Med. 2013 May 20;19 (1): 79-87.
2. Minetti G. C., Colussi C., Adami R., Serra C.,  Mozzetta C., Parente V., Illi B., Fortuni S., Straino S., Gallinari P., Steinkhuler C., Capogrossi M., Sartorelli V., Bottinelli R., Gaetano C., Puri P.L.  Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors.  Nature Medicine 12 (10): 1147-50 (2006).
3. Bettica P., Petrini S., D'Oria V., D'Amico A., Catteruccia M., Pane M., Sivo S., Magri F., Brajkovic S., Messina S., Vita GL, Gatti B., Moggio M., Puri PL, Rocchetti M., De Nicolao G., Vita G., Comi GP, Bertini E., Mercuri E. Histological effects of givinostat in boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2016 Oct; 26 (10): 643-649.
4. Mozzetta C., Consalvi S., Saccone V., Tierney M., Diamantini A., Mitchell KJ, Marazzi G., Borsellino G., Battistini L., Sassoon D., Sacco A., Puri PL. Fibroadipogenic progenitors mediate the ability of HDAC inhibitors to promote.regeneration in dystrophic.muscles of young, but not old Mdx mice. EMBO Mol. Med. 2013 Apr;.5 (4): 626-39. 
5. Saccone V., Consalvi S., Giordani L., Mozzetta C., Barozzi I., Sandonà M., Ryan T., Rojas-Muñoz A., Madaro L., Fasanaro P., Borsellino G., De Bardi M., Frigè G., Termanini A., Sun X., Rossant J., Bruneau BG, Mercola M., Minucci S., Puri PL. HDAC-regulated myo miRs control BAF60 variant exchange and direct the functional phenotype of fibro-adipogenic progenitors in dystrophic muscles. Genes Dev. 2014 Apr 15;28 (8): 841-57.
6. Colussi C., Mozzetta C. Gurtner A., Illi B., Rosati J., Straino S., Ragone G., Pescatori M., Zaccagnini G., Antonini A., Minetti G., Martelli F., Piaggio G., Gallinari P., Steinkuhler C., Clementi E., Dell'Aversana C., Altucci L., Mai A., Capogrossi MC, Puri PL, Gaetano C. HDAC2 blockade by nitricoxide and histone deacetylase inhibitors reveals a common target in Duchenne muscular dystrophy treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 9;105(49): 19183-7. 
7. Sandonà M., Consalvi S., Tucciarone L., De Bardi M., Scimeca M., Angelini DF, Buffa V., D'Amico A., Bertini ES, Cazzaniga S., Bettica P., Bouché M., Bongiovanni A., Puri PL, Saccone V. HDAC inhibitors tune miRNAs in extracellular vesicles of dystrophic muscle-resident mesenchymal cells. EMBO Rep. 2020 Sep 3; 21(9): e50863. 

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