Il ruolo dell’inibitore delle Istone deacetilasi (HDAC) Givinostat sul rimodellamento cardiaco nei topi MDX
Titolare del progetto: Roberto Rizzi, Istituto di Biologia Cellulare e Neurobiologia CNR di Roma.
Durata: 3 anni
Importo: 60.000 euro
Progetto finanziato da Parent Project aps
Come ben noto la distrofia muscolare di Duchenne colpisce tutti i muscoli scheletrici, compresi i muscoli respiratori e il tessuto cardiaco. Come gli altri muscoli, deputati alla deambulazione e al movimento, con l’avanzare della patologia il cuore va incontro a un indebolimento e a un importante processo infiammatorio e fibrotico che ne compromette la funzionalità. Uno degli aspetti più critici della Duchenne è, infatti, l’insorgere di gravi cardiomiopatie. Ad oggi sono molteplici le strategie terapeutiche in corso di sperimentazione per la DMD, e gran parte di queste si basano su molecole antiinfiammatorie che mirano a ridurre l’infiammazione, la fibrosi e la degenerazione del tessuto muscolare in generale, ma sono ancora pochi gli approcci che puntano ad agire direttamente sul tessuto cardiaco. Ed è proprio questo l’obiettivo del progetto guidato da Roberto Rizzi dell’Istituto di Biologia Cellulare e Neurobiologia del CNR (Consiglio Nazionale delle Ricerche) di Roma: studiare, in topi modello per la DMD, l’effetto di givinostat sul cuore.
Givinostat è un inibitore delle istone deacetilasi (HDAC) e agisce a livello epigenetico, ovvero su quei complessi meccanismi cellulari che influiscono sull’accensione e sullo spegnimento dei geni. In particolare, givinostat riattiva la corretta cascata di eventi molecolari che permette al tessuto muscolare di rispondere al danno con un meccanismo antiinfiammatorio e rigenerativo. Il percorso di sviluppo clinico di questa molecola sperimentale per la Duchenne è iniziato nel 2013 e, ad oggi, è in corso un trial clinico di fase 3. I dati disponibili delle sperimentazioni cliniche condotte sui bambini Duchenne hanno dimostrato che givinostat è sicuro, ben tollerato e mostra un beneficio significativo sul tessuto muscolare: è in grado di ridurre l’infiammazione e la fibrosi con un aumento della componente muscolare. Non vi è però ancora nessun dato disponibile sull’eventuale beneficio di givinostat sul tessuto cardiaco e sulla sua funzionalità nei pazienti Duchenne.
Ed è proprio per questo che lo scorso settembre è stato avviato il progetto triennale, dal titolo “Il ruolo dell’inibitore delle istone deacetilasi (HDAC) givinostat sul rimodellamento cardiaco nei topi mdx”, guidato da Roberto Rizzi e finanziato da Parent Project onlus con 60.000 Euro. Il razionale dello studio non si basa semplicemente sull’ormai nota attività antiinfiammatoria di givinostat nella Duchenne, ma anche su un altro importante presupposto: una sua possibile proprietà cardioprotettiva. Negli ultimi anni, diversi studi hanno dimostrato che gli enzimi HDAC entrano in azione a seguito di un danno cardiaco contribuendo ad instaurare uno stato infiammatorio che è il primo passo verso la degenerazione del tessuto cardiaco, il cosiddetto “rimodellamento” del cuore. Questo rimodellamento è caratterizzato da ipertrofia e da deposizione di tessuto fibroso, un processo che avviene con una migrazione di specifiche cellule endoteliali. Da notare che un processo molto simile è anche alla base della formazione del cuore durante lo sviluppo embrionale (cardiogenesi). Utilizzare quindi un inibitore di HDAC, quale givinostat, potrebbe combattere l’infiammazione e la successiva degenerazione del tessuto cardiaco, preservandone così la funzionalità.
Questo studio si basa su importanti risultati preliminari ottenuti dal gruppo di ricerca di Rizzi negli scorsi anni. Innanzitutto, una serie di esperimenti condotti su modelli animali hanno mostrato che la somministrazione di givinostat migliora la performance muscolare cardiaca sia in topi che hanno subito un infarto del miocardio, sia in topi mdx (il modello murino per la Duchenne). Inoltre, i ricercatori hanno osservato un effetto positivo di givinostat su quei meccanismi molecolari protettivi innescati a seguito di un danno cardiaco (come spiegato precedentemente), con un’azione inibitoria sul rimodellamento del cuore.
L’obiettivo del progetto è di studiare gli effetti di givinostat sulla cardiomiopatia associata alla Duchenne, causata quindi da mutazioni della distrofina. Nello specifico lo studio sarà condotto in due diverse fasi.
La prima fase sarà focalizzata sull’analisi degli effetti della somministrazione di givinostat in topi mdx. Il protocollo prevede diverse modalità di somministrazione: una singola somministrazione o trattamenti di lunga durata (30 e 60 giorni). Gli esperimenti saranno condotti sia su topi giovani che più vecchi, questo viene fatto per studiare l’effetto del farmaco in diversi stadi della malattia (precoce e avanzato). Gli effetti di givinostat verranno valutati mediante analisi istologiche, funzionali (ecocardiogramma ed emodinamica) e di espressione genica del tessuto cardiaco. Lo scopo di questa prima fase è di confermare i dati preliminari riguardanti un effetto benefico di givinostat sulla fibrosi e sul rimodellamento del tessuto cardiaco, e di riuscire a determinare il dosaggio e le tempistiche di azione del farmaco per prevenire o limitare il danno.
La seconda fase sarà invece mirata a studiare, in modelli animali (in vivo) e cellulari (in vitro), il ruolo cardioprotettivo di givinostat nei meccanismi molecolari che influenzano il rimodellamento del tessuto cardiaco e, in particolar modo, nel processo di cardiogenesi. Gli esperimenti in vitro saranno condotti effettuando analisi istologiche e molecolari su cardiomiociti, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali (la cui migrazione guida il processo fibrotico). Gli esperimenti in vivo saranno invece effettuati somministrando givinostat in topi femmina mdx gravide per valutarne l’effetto sulla cardiogenesi embrionale e sulla successiva insorgenza di cardiomiopatia nella prole. Questa fase del progetto è molto interessante per poter caratterizzare i meccanismi molecolari indotti dal farmaco e definirne le cellule bersaglio. Inoltre, sul fronte della cardiogenesi, lo studio potrebbe rivelare se una somministrazione molto precoce di givinostat è in grado di influenzare il processo di rimodellamento del tessuto cardiaco in maniera tale da prevenire l’insorgenza di una cardiomiopatia associata alla Duchenne.
L’obiettivo finale dello studio è quindi di dimostrare, per la prima volta, l’azione protettiva di givinostat nei processi patologici cardiaci. Questo suo ruolo, e la caratterizzazione dei processi molecolari, renderebbe givinostat un potenziale candidato terapeutico per prevenire o attenuare la cardiomiopatia associata alla distrofia muscolare di Duchenne
Approfondimento
Report Finale
REPORT FINALE DEL PROGETTO DI RICERCA IL RUOLO DELL’INIBITORE DELLE ISTONE DEACETILASI (HDAC) GIVINOSTAT SUL RIMODELLAMENTO CARDIACO NEI TOPI MDX
Iniziato a settembre del 2017, il progetto triennale guidato da Roberto Rizzi dell’Istituto di Biologia Cellulare e Neurobiologia del Consiglio Nazionale delle Ricerche di Roma aveva come obiettivo principale quello di studiare, nei topi modello per la DMD, l’effetto di givinostat sul cuore. Nei topi distrofici è stato precedentemente dimostrato che l’innervazione del cuore è notevolmente ridotta. Questo fenomeno genera una grave insufficienza cardiaca. Il cuore distrofico presenta inoltre aree fibrotiche e un aumento delle proteine della cosiddetta matrice extracellulare, lo spazio tra le cellule dei tessuti occupato da una rete intricata di macromolecole. L’ipotesi fatta dal gruppo di Roberto Rizzi è che la composizione della matrice extracellulare distrofica impedisce lo sviluppo dell’innervazione cardiaca, portando alla perdita del tono muscolare. Lo scopo principale della ricerca è stato proprio quello di caratterizzare gli effetti di givinostat sul ripristino dell’innervazione cardiaca e di conseguenza sul recupero delle funzionalità del cuore. I risultati dimostrano che la somministrazione giornaliera di givinostat nei topi fino a 60 giorni, aumenta la frazione di accorciamento, che indica la porzione di sangue che il cuore espelle dal ventricolo sinistro a ogni battito cardiaco. Il recupero delle funzionalità cardiache è concomitante alla riduzione della fibrosi e delle proteine che costituiscono la matrice extracellulare. I ricercatori hanno dimostrato inoltre che l’accumulo di una particolare macromolecola (proteoglicano condroitin-4-solfato: CSPG4) nella matrice extracellulare distrofica è in grado di impedire una corretta innervazione cardiaca. I dati finora raccolti hanno identificato i macrofagi (cellule del sistema immunitario) come principali produttori di CSPG4 e dimostrato che givinostat è in grado di ridurre l’accumulo di queste cellule e di CSPG4 e conseguentemente di ripristinare la corretta innervazione cardiaca nei topi distrofici
Il progetto si basa sulla caratterizzazione degli effetti di un farmaco epigenetico, l’inibitore delle istone deacetilasi (HDACi) givinostat (Giv), nel trattamento della cardiomiopatia distrofica nel topo mdx, modello animale per lo studio della distrofia muscolare di Duchenne (DMD).
Nella DMD il cuore subisce cambiamenti morfologici caratterizzati dall’accumulo incontrollato di fibrosi che impedisce alle cellule cardiache, i cardiomiociti, di contrarsi in modo funzionale. L’obiettivo di questa ricerca è quello di studiare in modo approfondito le cause che portano all’indebolimento del cuore nei pazienti DMD. Il cuore è un organo ampiamente innervato da fibre nervose dette simpatiche e parasimpaticheche regolano la frequenza e la forza della contrazione cardiaca. Recentemente è stato dimostrato che nei topi mdx l’innervazione simpatica è notevolmente ridotta e porta a grave insufficienza cardiaca. Quello che ancora non è noto, è la causa di questa mancata innervazione. Il cuore distrofico, inoltre, presenta aree fibrotiche e un aumento di proteine della matrice extracellulare (ECM), un’intricata rete di macromolecole che funge da substrato per l’adesione, la migrazione e il differenziamento delle cellule. Queste ultime, attraverso il rilascio di fattori di crescita e interagendo tra loro, determinano la composizione della ECM.
La nostra ipotesi è che la composizione della ECM distrofica impedisca lo sviluppo dell’innervazione cardiaca, portando così alla perdita del tono muscolare. In particolare lo scopo della ricerca è quello di caratterizzare per la prima volta gli effetti di givinostat sul ripristino dell’innervazione cardiaca e di conseguenza sul recupero delle funzionalità del cuore. Il farmaco agisce a livello epigenetico, ovvero su quei meccanismi cellulari che portano all’accensione o allo spegnimento di determinati geni. Grazie alle sue proprietà antiinfiammatorie e antifibrotiche si presenta come un candidato ideale per il trattamento della cardiomiopatia distrofica.
I nostri risultati in vivo hanno dimostrato che la somministrazione giornaliera di givinostat nei topi mdx fino a 60 giorni, aumenta la frazione di accorciamento, che indica la porzione di sangue che il cuore eietta dal ventricolo sinistro a ogni battito cardiaco. Il recupero delle funzionalità cardiache è concomitante alla riduzione della fibrosi e delle proteine che costituiscono l’ECM. L’analisi proteomica eseguita su cuori murini mdx ha evidenziato inoltre, una deregolazione nell’espressione di proteine correlate alla deposizione di componenti della ECM e dell’innervazione. In particolare abbiamo dimostrato che l’accumulo del proteoglicano condroitin-4-solfato (CSPG4) nella ECM distrofica è in grado di inibire la crescita assonale e impedire una corretta innervazione cardiaca. Dati molecolari, analisi citofluorimetriche e analisi istologiche hanno identificato come principali produttori di CSPG4 i macrofagi, cellule appartenenti al sistema immunitario. Givinostat è in grado di ridurre l’accumulo dell’infiltrato infiammatorio e di CSPG4 e conseguentemente di ripristinare la corretta innervazione cardiaca nei topi mdx. I nostri risultati hanno inoltre rilevato che il farmaco, nei macrofagi isolati da topi mdx, è in grado di regolare l’interazione di due noti fattori trascrizionali (NF-kB e Sp1) sul promotore dell’enzima CHST11 responsabile dell’accumulo di CSPG4.
In futuro, sarà fondamentale caratterizzare il ruolo di CSPG4 nella giunzione neurocardiaca in vitro attraverso la generazione di un modello tridimensionale (3D) bio-stampato. Il “costrutto” 3D sarà basato su una disposizione geometrica definita, per la tri-coltura di neuroni del ganglio cervicale superiore, fibroblasti e cardiomiociti isolati da topi WT e mdx. Questo permetterà di riprodurre in vitro un modello tissutale molto fedele a quello naturale e di validare il meccanismo alla base della mancata innervazione cardiaca nel topo mdx.
Attraverso questo progetto abbiamo, per la prima volta, rivolto l’attenzione sul “non” canonico rapporto tra compagine nervosa e miocardio in un contesto distrofico. A oggi, la maggior parte degli approcci terapeutici hanno come obiettivo principale quello di contrastare la perdita della funzionalità muscolare e pochissimi mirano al ripristino del corretto funzionamento del cuore, il quale, invece, ha un ruolo fondamentale nel migliorare l’aspettativa di vita e le condizioni generali dei giovani pazienti.
